卵巢早衰患者TBP2基因研究及助孕方式初探

【摘要】：早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency,POI)是一种多病因引起的女性在40岁前卵巢功能减退,临床表现为停经或月经稀发4-6个月,间隔4 周连续两次卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)25 IU/L。近年来,业界普遍认为过去常用的卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)不能体现该疾病的发生发展过程,因而诊断标准中将FSH数值由40IU/L降至25IU/L。诊断阈值的下调意味着将有更多女性进入POI的管理范畴,以便尽早引起妇产科医生的关注,让POI患者得到及时的诊断与治疗。据报道,POF的发病率约为1%,中国女性中的发病率约为2.8%,该病对女性的健康及生育力会造成严重影响,导致不孕、骨质疏松、泌尿生殖器官萎缩、心血管疾病、认知功能减退及抑郁等,应在临床上得到早期的诊断和干预,以提高患者的生活质量,目前该病已成为妇科生殖内分泌领域研究的热点。由于本课题中进行基础研究的病例样本所属者和临床研究中跟踪随访的患者均为近4-5年间就诊者,且均是以FSH40IU/L作为诊断标准确诊的卵巢早衰患者。因此,本文中相关疾病的描述仍以”卵巢早衰(POF)”为主。卵巢早衰的病因复杂多样,包括遗传学因素、免疫性因素、医源性因素、代谢性因素以及病毒感染等。其中遗传学因素被认为是首先需要关注的重要因素,包括染色体数目与结构异常,基因变异等。本课题以遗传学因素作为卵巢早衰病因研究的切入点,在对已发表的与卵巢早衰发生相关的基因变异(包括基因多态性、基因突变等)相关性文献进行大量阅读分析的基础上,筛选出TATA结合蛋白2(TATA-binding protein 2,TBP2)这一基因。通过对近4年来已收集的中国汉族女性特发性卵巢早衰病例样本的相关实验研究,探讨TBP2基因是否参与卵巢早衰的发病。此外,在临床研究方面,卵巢早衰所导致的不孕症是育龄期女性面临的严峻问题,本课题通过对确诊为卵巢早衰性不孕症但因有生育要求而采取辅助生殖技术(自然周期或微刺激周期的体外受精-胚胎移植)助孕的患者进行3-4年的跟踪随访,经过不同助孕方式及对应生育结局的比较,初步探讨临床上卵巢早衰患者不同助孕方式的效果及其与妊娠结局的相关性。通过上述的基础研究,一方面,进一步探索基因变异与卵巢早衰发病的相关性,为深入明确卵巢早衰的遗传学病因提供一定的依据,从而为卵巢早衰的病因分析及早期诊断提供理论依据。另一方面,上述的初步临床研究也为卵巢早衰性不孕症患者通过选择不同的方式助孕从而获得较好的生殖结局提供了一些有价值的参考,进而为临床应用中卵巢早衰的生育相关性诊疗提供指导依据。第一部分卵巢早衰患者TBP2基因的相关研究目的:前期研究报道提示,TBP2基因特异性表达在小鼠卵巢,且该基因敲除的雌性小鼠是不孕的。本研究拟通过检测中国汉族卵巢早衰女性中TBP2基因的7个外显子,探讨该基因与卵巢早衰发病的关系。方法:研究对象为南京医科大学第一附属医院门诊就诊并被确诊的中国汉族特发性卵巢早衰患者60例及年龄匹配、月经正常、性激素检查在正常范围的对照女性60名,收集其外周血样本纳入研究。采用血基因组DNA提取试剂盒提取外周血白细胞中的DNA,并用UCSC ExonPrimer online software设计针对TBP2基因的引物,应用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)特异性扩增TBP2基因所有7个外显子的编码区及其侧翼序列,并对POF试验组和对照组的TBP2基因扩增序列进行测序分析,所得序列利用核苷酸序列比对编辑工具以及哈代-温伯格平衡定律(Hardy-Weinberg equilibrium,HWE)等进行综合分析。关于TBP2基因错义突变所致的潜在功能性或结构性影响则由基于ClustalX和PolyPhen2的程序进行预测。另外,应用卡方检验比较单核苷酸多态性位点(single-nucleotide polymorphism,SNP)的基因型和等位基因频率在卵巢早衰组及对照组间的分布情况。结果:测序结果发现,在卵巢早衰组和对照组中均发现一个常见的单核苷酸多态性位点(c.92GC),两组中该位点的基因型分布和等位基因频率的比较也无统计学差异(P0.05),且没有结果表明出现合理的致病性突变。结论:我们的研究显示,中国汉族女性中TBP2基因的SNP位点(c.92GC)可能与特发性卵巢早衰的发生无关。第二部分 卵集早衰性不孕患者助孕方式的临床初探目的:卵巢早衰(POF)是一种复杂的生殖内分泌疾病,育龄期的POF女性较难自发获得妊娠。本研究拟通过分析50例应用自然周期IVF-ET(in vitro fertilization-embryo transplantation)方案或微刺激周期 IVF-ET 方案的 POF 性不孕症女性的生育结局,评估这两种辅助生殖方案的疗效,进而探讨临床上该类病人不同助孕方式的效果。方法:近4年来在南京医科大学第一附属医院生殖中心收集到POF性不孕症的女性172例(包括应用自然周期方案的74例和应用微刺激周期方案的98例),其中有50例患者在应用不同方案IVF-ET的助孕方式后成功妊娠。将此50例患者根据所采用的IVF治疗方案分为A,B两组,A组17人,为应用自然周期方案获得妊娠,B组33人,为应用微刺激周期方案获得妊娠。所有纳入的患者均具有正常的染色体核型(46,XX),已排除盆腔因素或其它系统性疾病所致的不孕,其伴侣均具有良好的生育能力。回顾性分析所有研究对象的年龄、初潮年龄、身体质量指数(body mass index,BMI)、不孕年限、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(luteinizing hormone,LH)、雌二醇(estradiol,E2)、睾酮(testosterone,T),泌乳素(prolactin,PRL)等性激素水平,双侧卵巢窦卵泡数(antral follicle count,AFC)、甲状腺功能以及她们的生育结局,从而评估不同助孕方式的疗效。结果:对于A、B两组不孕症患者,在进行辅助生殖技术(assisted reproductive technology,ART)治疗前,血FSH水平均高于40IU/L(符合POF的诊断标准)。基本情况方面,两组患者在年龄、初潮年龄、BMI、不孕年限,妊娠次数及基础窦卵泡数等方面均无明显差异(P0.05)。进一步发现,应用雌孕激素联合序贯治疗(combination estrogen and progesterone hormone replacement therapy,HRT)三个月以上,检测两组患者的性激素水平,结果显示,A,B两组患者的血FSH、LH 及 E2 水平分别为[A 组:FSH(10.39±5.83)IU/L,LH(3.75±2.07)IU/L,E2(44.53±63.00)pg/ml。B 组:FSH(12.18±6.06)IU/L,LH(4.19±1.80)IU/L,E2(43.40±61.35)pg/ml],比较无显著差异(P0.05)。此外,A组中含有1例甲状腺功能异常的患者而B组中有7例,A、B两组中各包含一例高泌乳素血症的病患者。生育结局方面,有14例患者应用自然周期方案后获得临床妊娠且均为活产,自然周期组的临床妊娠率为18.9%(14/74)。有29例患者应用微刺激周期方案后获得临床妊娠,其中活产为25例,因而微刺激周期组的临床妊娠率为29.6%(29/98)。比较发现,自然周期组和微刺激周期组在临床妊娠率方面无明显差异(P0.05)。除此之外,A组中患者中没有流产或宫外孕发生,B组患者中包括了 4例流产及1例宫外孕。结论:POF不孕症女性很难自然妊娠,多数需要通过赠卵IVF获得妊娠。本研究结果提示自然周期或微刺激周期的IVF-ET方案可能为POF/POI患者生育治疗的一种有效方法。

【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R711.75